Ārstniecībā izmantojamo medicīnisko tehnoloģiju datu bāze

Medicīniskās apaugļošanas tehnoloģijas un to lietošanai nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums

Izvērsts medicīniskās tehnoloģijas metodes apraksts

Medicīniskās apaugļošanas tehnoloģijas un to lietošanai nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums

1. Ievads

Medicīniskā apaugļošana ir vīrieša un sievietes dzimumšūnu sapludināšana, kurā kāds no auglības traucējumu ārstēšanas etapiem notiek ārpus ķermeņa. Tā ietver visas procedūras, lai iestātos grūtniecība, tai skaitā, in vitroapaugļošanu un embriju pārnesi sievietes dzemdes dobumā, kā arī dzimumšūnu uzglabāšanu, oocītu un embriju donēšanu.

Termini un skaidrojumi

  • Aglutinācija, spermaglutinācija – kustīgo spermatozoīdu savstarpēja salipšana ar galviņām, astēm vai galviņām ar astēm;
  • AH – asistētais hetčings (starptautiski pieņemts saīsinājums no Assisted Hetching) – laboratorijas tehnika, kad embrija zona pellucida slānī, izmantojot mikromanipulatoru, tiek izveidota atvere, ar mērķi veicināt embrija implantāciju endometrijā;
  • ART – asistētās reproduktīvās tehnoloģijas;
  • Astenozoospermija – spermatozoīdu kustīgums ir zemāks par normatīvajām vērtībām (progresīvi kustīgie –mazāk kā 32%, progresīvi un neprogresīvi kustīgie –mazāk kā 40%);
  • Azoospermija – stāvoklis, pie kura spermas šķidrumā nav spermatozoīdu;
  • Blastocista – embrijs, kuram ir izveidojies ar šķidrumu pildīts blastoceles dobums (parasti 5-6 dienas pēc apaugļošanās);
  • Donors – persona, no kuras tiek iegūtas olšūnas vai spermatozoīdi nolūkā izmantot recipientam. Donora dzimumšūnas, kas paredzamas medicīniskajai apaugļošanai, glabājas donora dzimumšūnu bankā;
  • Embrijs (cilvēka) – cilvēka aizmetni līdz 8.grūtniecības nedēļai;
  • Embriotransfērs, embriju pārnese (ET) – embriju ievadīšana dzemdes dobumā caur dzemdes kaklu ar speciālu katetru;
  • Fertilizācija – apaugļošanās;
  • Folikuls – neliels, augošs pūslītis olnīcā, pildīts ar šķidrumu, kurā attīstās olšūna;
  • Folikulu punkcija – operācija, kuru izdara olnīcu stimulācijas beigās, lai no olnīcu folikuliem iegūtu olšūnas;
  • GnRH agonisti – medikamentu grupa, gonadotropīnu atrīvotājhormona agonists;
  • HIV - cilvēka imūndeficīta vīruss;
  • ICSI - Intracelulāra viena spermatozoīda injekcija olšūnā (starptautiski pieņemts saīsinājums no Intra Cytoplasmatic Sperm Injection);
  • Idiopātiskā neauglība – nezināma iemesla izraisīta neauglības forma;
  • Imunoloģiskā neauglība – neauglības forma, saistīta ar imūnās sistēmas traucējumiem sievietes organismā, kā rezultātā sperma tiek uztverta kā svešķermenis, radot organisma imūnās atbildes reakcijau;
  • Inkubācija – noteiktu objektu turēšana noteiktā vidē (parasti vidē ar konkrētu temeperatūras diapozonu);
  • Inseminācija – sagatavotu spermatozoīdu suspensijas pārnešana dzemdes dobumā;
  • In vitro – ārpus ķermeņa (burtiski - mēģenē);
  • IUI - Intra uterinārā inseminācija (straptautiski pieņemts saīsinājums no Intrauterine Insemination);
  • IVF - Medicīniskā apaugļošana mēģenē (starptautiski pieņemts saīsinājums no In Vitro Fertilization);
  • IVM - Oocītu nobriedināšana (starptautiski pieņemts saīsinājums no In Vitro Maturation);
  • Lēnā sasaldēšana – sasaldēšanas metode, kas balstās uz pakāpensisku, kontrolētu temperatūras samazināšanu;
  • MikroTESE - testikulāro un epididimālo spermatozoīdu iegūšana, izmantojot mikroskopijas metodes;
  • Neauglība – dzimumbriedumu sasniegušu divu pretēju dzimumu personu nespēja radīt pēcnācēju gada laikā, dzīvojot regulāru dzimumdzīvi bez kontracepcijas;
  • Normozoospermija – visi spermas rādītāji atbilst labas spermas kvalitātes prasībām pēc Pasaules Veselības organizācijas noteiktajiem standartiem;
  • Oligoastenoteratozoospermija – spermas patoloģija, kuras gadījumā ir pazemināta spermatozoīdu koncentrācija, samazināts spermatozoīdu kustīgums un spermatozoīdu morfoloģiskie kritēriji;
  • Oligospermija – ejakulāta apjoms ir mazāks par 1,5 ml;
  • Oligozoospermija – spermatozoīdu koncentrācija ejakulātā spermas porcijā mazāka kā 20 mlj/ml vai samazināts spermatozoīdu daudzums kopējā ejakulātā (<39 milj);
  • Oligozoospermija – spermatozoīdu koncentrācija ejakulātā spermas porcijā ir mazāka nekā 20 mlj./ml;
  • Ovulācijas stimulācija – medikamentozu hormonālu preparātu ievadīšana sievietes organismā, kas veicina folikulu un olšūnu nobriešanu;
  • Olšūna, oocīts – sievietes dzimumšūna;
  • Ovulācija – folikula plīšana, kuras rezultātā olšūna izkļūst no olnīcas;
  • PCOS – policistisku olnīcu sindroms;
  • PESA, PESE – perkutāna epididimāla spermas aspirācija;
  • PICSI – fizioloģiska intracelulāra viena spermatozoīda injekcija olšūnā (starptautiski pieņemts saīsinājums no Physiological Intra Cytoplasmatic Sperm Injection);
  • Retrogrāda ejakulācija – vīrieša reproduktīvās funkcijas traucējums, kurā sperma ejakulācijas laikā nonāk urīnpūslī;
  • Spermatozoīds – vīrieša dzimumšūna;
  • Sperma – sēklas šķidrums, kurš satur spermatozoīdus;
  • Teratozoospermija – vairāk kā 96 % patoloģiskas uzbūves spermatozoīdu klātbūtne ejakulātā vai stāvoklis, pie kura normālas uzbūves spermatozoīdu daudzums spermā mazāk kā 4 % ;
  • TESA, TESE- testikulāro un epididimālo spermatozoīdu iegūšana (starptautiski pieņemts saīsinājums no Testicular Epididymal Sperm Extraction);
  • TZI – tetrazoospermijas indeks – morfoloģiski abnormālo spermatozoīdu procentuālais daudzums spermas paraugā;
  • Vitrifikācija – ātra sasaldēšanas metode, kuras laikā neveidojas ledus kristāli;
  • Zigota – diploīda šūna, kas rodas spermatozoīdam apaugļojot olšūnu;
  • ZP – zona pellucida – glikoproteīnu slānis, kas ietver zīdītāju olšūnu plazmatisko membrānu.

2. Realizācija un nosacījumi

2.1. Indikācijas medicīniskās apaugļošanas metožu pielietošanai

2.1.1. Olnīcu stimulācija

  • Sievietes neauglība:

- Anovulācija (neveidojas folikuli);

- Sagatavošana IUI;

- Sagatavošana IVF;

- Sagatavošana ICSI.

2.1.2.Intrauterīnā inseminācija (IUI)

  • Sievietes neauglība:

- Konservatīva neauglības ārstēšana, kuras pielietošanas rezultātā gada laikā nav iestājusies grūtniecība;

- Seksuālas disfunkcijas;

- Donora spermas izmantošana, ja sievietei nav partnera.

  • Vīrieša neauglība:

- Seksuālas disfunkcijas;

- Normozoospermija ar patoloģisku konsistenci;

- Normozoospermija ar aglutināciju < 5%

- Retrogradā ejakulācija, ja visi citi spermas parametri atbilst normozoospermijai.

2.1.3. Ārpusķermeņa apaugļošana (IVF)

  • Sievietes neauglība:

- Sievietei nav olvadu (pēc operācijām, iedzimta patoloģija);

- Olvadu caurlaidība traucēta vai tie pilnīgi slēgti;

- Ja nav iestājusies grūtniecība gada laikā pēc mikroķirurģiskas olvadu operācijas;

- Hormonālas izcelsmes neauglība;

- Ovulācijas traucējumi, ja ovulācijas stimulācija nav devusi rezultātus;

- Idiopātiska neauglība;

- Endometrioze (I-II stadija, ja gada laikā pēc ārstēšanas nav iestājusies grūtniecība), III-IV stadija pēc GnRH agonistu terapijas;

- Dažāda veida konservatīvas vai operatīvas neauglības ārstēšanas metodes, pēc kuru pielietošanas nav iestājusies grūtniecība;

- gada laikā, ja sievietes vecums zem 35 gadiem,

- pusgada laikā, ja sievietes vecums virs 35 gadiem.

  • Vīrieša neauglība:

- Vieglas formas asteno- un teratozoospermija, ja spermatozoīdu koncentrācija ir >15x106milj./ml un spermatozoīdu kopējā koncentrācija ir >39x106milj.;

- Retrogradā ejakulācija, ja visi citi parametri atbilst vismaz iepriekšējā punktā minētajiem;

- Normozoospermija ar patoloģisku konsistenci;

- Normozoospermija ar aglutināciju <15%;

- Idiopātiska neauglība;

2.1.4. Intracitoplazmatiskā viena spermatozoīda injekcija olšūnā (ICSI)

  • Sievietes neauglība:

- Hronisks B un/vai C vīrushepatīts;

- B un/vai C hepatīta nēsātāja;

- HIV;

- Folikulu punkcijas laikā iegūts ļoti mazs (zemāks nekā 5) nobriedušo olšūnu skaits;

- Zems fertilizācijas procents iepriekšējā IVF procedūrā – mazāks par 20 - 25%;

- Imunoloģiska neauglība;

- Neskaidras etioloģijas neauglība.

  • Vīrieša neauglība:

- Hronisks B un/vai C vīrushepatīts;

- B un/vai C hepatīta nēsātājs;

- HIV;

- Spermatozoīdu aglutinācija >15%;

- Vidēji smagas un smagas formas oligoastenoteratozoospermija:

- Spermatozoīdu koncentrācija <15x106milj./ml, spermatozoīdu kopskaits ejakulātā <39x106milj.;

- Spermatozoīdu progresīvais kustīgums – mazāks par 25%;

- Spermatozoīdu morfoloģija – mazāka par 4 %;

- Spermas tilpums < 0,5 ml;

- Oligozoospermija pie retrogrādas ejakulācijas;

- TZI >1,6;

- Imunoloģiskā neauglība;

- Neskaidras etioloģijas neauglība.

2.1.5. Fizioloģiskā intracitoplazmatiskā viena spermatozoīda injekcija olšūnā

  • Vīrieša neauglība:

- Spermatozoīdu piesaiste hialuronātam zem 80%;

- Fertilizācijas procents iepriekšējā ICSI procedūrā – mazāks par 50%;

- Vīrieša vecums >45 gadiem;

- Oligozoospermija pie retrogrādas ejakulācijas;

- Neskaidras etioloģijas neauglība.

2.1.6. Intracitoplazmatiskā viena spermatozoīda injekcija olšūnā (ICSI) ar TESA, TESE, PESA, PESE vai mikroTESA materiālu:

  • Vīrieša neauglība:

- Azoospermija (obstruktīvā forma vai neobstruktīvā forma).

2.1.7. IVM

- Pacientēm ar PCOS.

- Pacientēm ar hiperstimulācijas sindromu.

- Pacientēm ar onkoloģiskām saslimšanām pirms gonadotoksiskas terapijas uzsākšanas.

2.1.8. Donora spermas izmantošana

  • Vīrieša neauglība:

- Oligoastenoteratozoospermija;

- Azoospermijas neobstruktīvās formas (spermatoģenēzes apstāšanās dažādās attīstības stadijās);

- Ja nav iespējams iegūt spermatozoīdus no sēkliniekiem invazīvā ceļā- TESA, TESE, PESA, PESE vai mikroTESArezultātā;

- Staru slimība un staru terapija, lietota vīrietim;

- Vīrieša ģenētiskās saslimšanas.

  • Citi gadījumi:

- Smaga Rh faktora nesaderība;

- Atkārtoti nesekmīgi ICSI gadījumi;

- Sieviete bez partnera.

2.1.9. Donoru olšūnu izmantošana

  • Sievietes neauglība:

- Iedzimta olšūnu patoloģija;

- Iegūta olnīcu mazspēja (pēc staru vai ķīmijterapijas);

- Priekšlaicīgs olnīcu izsīkuma sindroms;

- Liels risks, ka bērns pārmantos no mātes ģenētisku slimību monogēno saslimšanu gadījumā;

- Antimillera hormona līmenis zem 0,28;

- Neizskaidrojama vairāku grūtniecību spontāna pārtraukšanās;

- Vairākkārtīgi stimulējot pacienti, nav izdevies iegūt olšūnu.

2.1.10. AH

- Zonas Pellucidas biezums vairāk kā 15 µm;

- Sievietes vecums >37 gadiem;

- Embriji vai embrijs ir ticis vitrificēts vai saldēts;

- Procedūrai izmantotas vitrificētas olšūnas;

- Zema embriju kvalitāte;

- Blastocista vēl nav sākusi iziet no ZP, vai ir iesākusi iziet un iesprūdusi;

- Iepriekšējas embriotransfēru (ET) procedūras, pēc kurām nav iestājusies gūtniecība;

- Blastocistām, ko pirms saldēšanas nepieciešams kollapsēt.

2.1.11. Dzimumšūnu donora izvēle

- Par dzimumšūnu donoru var būt vesela persona: vīrietis no 18-45 gadiem un sieviete vecumā no 18-35 gadiem;

- Potenciālais dzimumšūnu donors tiek medicīniski izmeklēts atbilstoši noteikumiem normatīvajos aktos.

2.2. Kontrindikācijas medicīniskās apaugļošanas metožu pielietošanai

2.2.1. Fizioloģiskais ISCI

- Spermatozoīdu koncentrācija <15 milj/ml

- Spermatozoīdu kustīgums - progresīvi kustīgi spermatozoīdi >20%

2.2.2. Blastocistu kultivācija

- Mazāk kā četri labas kvalitātes embriji to 3. attīstības dienā

- Slikta embriju kvalitāte 3. attīstības dienā.

2.2.3. Embriju transfers

- Vidēji smags/smags olnīcu hiperstimulācijas sindroms;

- Asiņošana no dzimumceļiem;

- Endometrija neatbilstība;

- Neatbilstoša embriju kvalitāte;

- Pēkšņa pacientes veselības stāvokļa pasliktināšanās pirms plānotā embriju transfēra.

2.2.4. Vitrifikācija

- Ētiski, reliģiski vai sociāli apstākļi.

2.2.5. In vitro nobriedināšana

- Ētiski, reliģiski vai sociāli apstākļi.

2.3. Brīdinājumi

2.3.1.Spermas sagatavošana

- Nepareizas metodes izmantošanas rezultātā iegūto spermatozoīdu daudzums un kvalitāte var neatbilst pielietotās apaugļošanas metodes prasībām.

2.3.2. Fizioloģiskais ISCI

- Nobriedušu un morfoloģiski pareizu spermatozoīdu izvēle nenodrošina 100% apaugļošanās rezultātu, pilnīgi neizslēdz hromosomālu anomāliju iespējamību embrijā, kā arī nenodrošina visu embriju attīstību līdz blastocistas stadijai, tā kā šajā procesā tiek saņemta ģenētiskā informācija no oocīta, kas var būt ar hromosomālām izmaiņām, mitohondriālo nepietiekamību.

2.3.3. Blastocistu kultivācija

- Tā kā nav izstrādāti universāli blastocistu attīstības prognozēšanas kritēriji, ir palielināts risks, ka, neskatoties uz normālu embriju attīstību 2. – 3. dienā, uz transfēru nebūs neviena embrija. Lai gan ir pierādījumi, kas liecina par to, ka blastomēru skaits un fragmentācijas pakāpe tieši korelē ar blastocistu attīstības potenciālu, tomēr spēja attīstīies blastocistai ievērojami atšķiras starp pacientiem, kas svārstās robežās no 0% līdz gandrīz 100%. Līdz ar to pacientiem, kuri piekrīt prolongētai embriju kultivācijai, ir jāapzinās ar to saistītās sekas un risks, ka embriju transfērs var tikt atcelts.

- Veicot tikai viena embrija transfēru dzemdes dobumā, vienmēr saglabajas daudzaugļu grūtniecības risks, jo pat viena embrija transfērs neizslēdz monozigotisko dvīņu attīstīšanās iespēju. Tas pats arī ir attiecināms uz divu blastocistu transfēru, kurš tāpat kā 2. – 3. attīstības dienas embriju pārstādīšana, vienmēr saistās ar daudzaugļu grūtniecības risku.

- Pacientiem, kuriem tiek veikta blastocistu kultivācija, ir lielāks risks, ka pēc transfēra būs mazāk embriju, kurus iespējams kriosaglabāt, nekā tas būtu, veicot 2. vai 3. dienas embriju transfēru. Tāpat vienmēr pastāv risks, ka embriju priekš kriosaglabāšanas nebūs.

2.3.4. Embriju transfers

- Veicot embriju transfēru dzemdes dobumā, vienmēr, neatkarīgi no pārstādīto embriju skaita, saglabajas daudzaugļu grūtniecības risks, jo pat viena embrija transfērs neizslēdz monozigotisko dvīņu attīstīšanās iespēju.

2.3.5. Vitrifikācija

- Vitrifikācijas procesā ir vairāki faktori, kas var būtiski ietekmēt metodes rezultātus:

  • krioprotektanta veids un koncentrācija (praktiski, visi krioprotektanti ir toksiski),
  • vitrifikācijas šķīdumu temperatūta procedūras laikā,
  • ekspozīcijas ilgums, kuru oocīti un embriji tiek noturēti pēdējā krioprotektantu šķīdumā pirms iegremdēšanas šķidrajā slāpeklī,
  • krionesēju veids un materiāls,
  • oocītu kvalitāte;
  • embriju kvalitāte un attīstības stadija,
  • personāla kvalifikācija.

- Tā kā visām šūnām ir bioloģiskās tolerances robeža, kas nosaka, cik lielu krioprotektanta koncentrāciju šūnas spēj izturēt, galvenā problēma vitrifikācijas metodes pielietošanā ir nepieciešamība lietot šķīdumus ar augstām krioprotektantu koncentrācijām. Tāpēc katra vitrifikācijas protokola mērķis ir palielināt temperatūru maiņas ātrumu, paralēli saglabājot krioprotektantu koncentrācijas pēc iespējas zemākas.

- Neskatoties uz literatūrā aprakstītajiem augstajiem pēc-vitrifikācijas izdzīvošanas rezultātiem, neviena kriosaglabāšanas metode nevar pilnība garantēt 100% labu atkausētu oocītu kvalitāti vai 100 % embriju izdzīvošanu - katram embrijam ir savs ģēnētiskais materiāls, kas nosaka tā individuālo toleranci pret ārējiem kairinātājiem. Pacientiem ir jaapzinās potenciālie kriosaglabāšanas riski un jabūt informētiem par iespējamiem negatīviem atkausēšanas rezultātiem.

2.4. Iespējamās komplikācijas

2.4.1. Embriju transfers

- ārpusdezemdes grūtniecība,

- asiņošana,

- infekcijas.

3. Medicīniskās apaugļošanas tehnoloģijas

3.1. Pirms procedūras periods

  • Medicīniskās apaugļošanas tehnoloģiju indikācijas nosaka ginekologs, dzemdību specialists vai urologs.
  • Pacientam un viņa piederīgajiem tiek vispusīgi izskaidrota plānotās ārstēšanas būtība, nepieciešamība, risks, ieguvums un iespējamās komplikācijas.
  • Pacients (vai viņa piederīgie/atbildīgās personas) apliecina piekrišanu procedūrai ar parakstu uz speciālas veidlapas „PACIENTA INFORMĒTĪBAS UN PIEKRIŠANAS FORMA ......”.
  • Veic vispārējās klīniski laboratoriskās analīzes, .......

3.2. Procedūra

3.2.1. Spermas papildus izmeklēšana

Svaigas spermas papildus izmeklēšana pirms veiksmīgas ART plānošanas (MAR tests, DNS fragmentācijas tests, oksidatīvā stresa tests, hialuronāna saistīšanas tests, magnētiskā apoptotisko spermatozoīdu atdalīšana) tiek realizēta atbilstoši attiecīgo testu veikšanai paredzēto medicīnisko ierīču lietošanas instrukcijai.

3.2.2. Spermas iegūšana un sagatavošana medicīniskai apaugļošanai

3.2.2.1. Svaigas spermas iegūšana no dzimumšūnu donora vai partnera tiek realizēta:

a) neinvazīvā jeb masturbācijas ceļā;

b) invazīvā ceļā – TESA, TESE, PESA, PESE, mikro TESE

3.2.2.2. Spermas sagatavošana

3.2.2.2.1. Spermas atmazgāšanas metode

Metodes pamatā ir labas kvalitātes spermas atmazgāšana un koncentrēšana kultivēšanas vidē centrifugējot.

- Sašķidrinājušos spermas materiālu atšķaida ar kultivēšanas vidi un centrifugē. Izvēlētajai apaugļošanas procedūrai izmanto nogulsnes: sakoncentrēts spermas materiāls.

3.2.2.2.2. Swim-up metode:

Metodes pamatā ir kustīgu spermatozoīdu spēja izpeldēt no spermas palzmas kutivēšanas vidē, tādējādi tos attīrot no spermas plazmas un nekustīgiem spermatozoīdiem. Swim-up metodi var veikt, izmantojot sekojošas procedūras:

- koniskā centrifugēšanas stobriņā ieplidot sašķidrinājušos spermas materiālu un virs tā lēnām uzslāņo kultivēšanas vidi;

- koniskā centrifugēšanas stobriņā iepilda kultivēšanas vidi un zem tās lēnām iepilda sasšķidrinājušosa spermas materiālu.

Kustīgie spermatozoīdi uzpeld kultivēšanas vides slānī, kuru tālāk izmanto izvēlētajai apaugļošanas procedūrai.

3.2.2.2.3. Blīvuma gradienta metode :

Metodes pamatā ir spermas materiāla centrifugēšana ar bīvuma gradientu, kas atdala šūnas atkarībā no to blīvuma. Turklāt kustīgi spermatozoīdi aktīvi peld prom caur blīvuma gradientu slāni un veido nogulsnes stobriņa dibenā. Rezultātā tiek atadalīti kustīgie (aktīvie) spermatozoīdi no spermas plazmas satura (leikocīti, deģenerējuši spermatozoīdi, citas šūnas un sabrukšanas produkti).

- Blīvuma gradienta centrifugācijas metodes procedūru veic ievērojot izmantotās vides ražotāja instrukcijas un audu un šūnu centra standartprocedūru

3.2.3. Spermas sasaldēšana, uzglabāšana un atkausēšana

Spermas sasaldēšana, uzglabāšana un atkausēšana tiek realizēta atbilstoši MT Latvijā apstiprinātā cilvēka spermas uzglabāšanas tehnoloģija un prasības tehniskajam aprīkojumam”.

3.2.4. In vitro nobriedināšana (IVM)

Oocītu IVM tiek realizēta atbilstoši metodes aprakstam izvērstā medicīniskā tehnoloģijā In vitro nobriedināšana– skat.pielikumā.

3.2.5. Oocītu vitrifikācija

- Oocītu vitrifikācijas procedūru veic stingri ievērojot ražotāja instrukcijas.

3.2.6. Blastocistu kultivācija

- Visas kultivācijas barotnes jāsagatavo pēc ražotāja instrukcijas.

- Olšūnas pēc ICSI manipulācijas tiek ievietotas kultivācijas barotņu pilienos, kas pārklāti minerāleļļu.

- Veicot IVF apaugļošanu, olšūnas uz pilieniem pārliek nākamajā dienā pirms apaugļošanās novērtēšanas.

- Apaugļošanos novērtē pēc 16 - 20 stundām.

- Otrajā dienā novērtē embriju pirmo dalīšanos.

- Trešajā dienā novērtē embriju otro dalīšanos, pārliek embrijus jaunās platēs, kurās pielieniem izmantota kultivācijas vide, kas īpaši paredzēta blastocistu kultivācijai. Alternatīvi: ja kultivāciju veic nepārtrauktas kultivācijas vidē, embriju pārlikšana uz platēm ar jaunu kultivācijas vidi neveic, t.i. embrijus nepārtrauktās kultivacijas vidē kultivē līdz tie sasniedz vēlamo attīstības stadiju.

- Ceturtajā dienā novērtē embriju tālāko attīstību.

- Embriju kultivāciju veic līdz piektajai/sestajai attīstības dienai, kad veic embriju transfēru - embriju/-us ievada sievietes dzemdes dobumā.

3.2.7. Embriju sasaldēšana un atkausēšana

- Vitrifikācijas procedūru veic stingri ievērojot ražotāja instrukcijas.

3.2.8. Assisted hatching

3.2.8.1.Embrija apvalka mehāniska atvēšana

- Uzstāda mikromanipulatoram pipetes, mikroinjekcijas pipetes vietā lieto Partial Zona Dissection Pipetti.

- No embriju kultivācijas plates pārnes ET izvēlētos embrijus uz sagatavoto embrija apvalka atvēršanas plati un novieto to uz mikromanipulātora.

- Ar mikropipetes (Partial Zona Dissection Pipette) palīdzību izveido ZP atveri- V vai X veida. Atvērumam embrija ZP ir jābūt pietiekoši lielam, lai pa to varētu iziet blastocista, kā arī pietiekoši mazam, lai pa to netiktu pazaudēti blastomēri, ja AH tiek veikts pirms embrija kompaktizācijas sākuma.

3.2.8.2.Embrija apvalka atvēršana izmantojot lāzeri

- Uzstāda mikromanipulatoram holdinga pipeti un ieslēdz lāzera datorprogrammu.

- No embriju kultivācijas plates pārnes ET izvēlētos embrijus uz sagatavoto embrija apvalka atvēršanas plati un novieto to uz mikromanipulātora.

- Embriju pietur ar holdinga pipetes palīdzību un izvēlas vietu lāzera stara šāvienam.

- Veic embrija apstrādi ar lāzeru izvēlētajā vienā vai vairākos punktos.

3.2.8.3.Embrija apvalka ķīmiska atvēršana (acid Tyrode)

- No embriju kultivācijas plates pārnes ET izvēlētos embrijus uz sagatavoto embrija apvalka atvēršanas plati un novieto to uz mikromanipulātora.

- Ar mikropipeti, kurā atrodas skābe, izveido ZP iedobumu, pilnībā neizsķīdinot ZP. Skābe nedrīkst iekļūt embrijā.

- Pēc AH procedūras embriju vairākas reizes skalo IVF šķīdumā un tad pārnes uz ET plati.

3.2.9. Spermas inseminācija sievietes dzimumorgānos (IUI)

- Ar vai bez olnīcu stimulācijas, inducējot ovulāciju un laikā sinhronizējot insemināciju ar ovulāciju;

- Sagatavo spermu,

- spermatozoīdu suspensijas ievadīšana sievietes dzimumorgānos (makstī/cervikālā kanālā/ dzemdes dobumā) notiek ultrasonoskopiskā kontrolē:

3.2.10. Medicīniskā apaugļošana “In vitro” (IVF)

  • spermas iegūšana neinvazīvā ceļā;
  • spermatozoīdu sagatavošana un izolēšana atbilstoši metodes aprakstam izvērstā medicīniskā tehnoloģijā “Spermas sagatavošana” – skat.pielikumā.
  • olšūnu iegūšana:

a. superovulācijas stimulācija vai dabīgs cikls;

b. olnīcu folikulu punkcija;

c. olšūnas un kumulusa šūnu kompleksu skalošana un attīrīšana no folikulārā šķidruma:

  • medicīniskā apaugļošana:

a. apaugļošanas vides sagatavošana;

b. spermatozoīdu sapludināšana ar vides pilieniem;

c. olšūnas un kumulusa šūnu kompleksu sapludināšana ar spermatozoīdiem vides pilienos - inseminācija;

  • inkubācija;
  • apaugļošanās jeb fertilizācijas novērtēšana (izvērtēšana) inversijas mikroskopā 16-20 stundas pēc procedūras (1. attīstības diena);
  • embriju novērtēšana inversijas mikroskopā līdz 3. attīstības dienai;
  • embriju kultivācija var tikt prolongēta līdz blastocistu stadijai atbilstoši metodes aprakstam izvērstā medicīniskā tehnoloģijā “Blastocistu kultivācija” – skat. pielikumā;
  • embriju atlase embriotransfēram;
  • embriotransfērs (ET) – manipulācija tiek realizēta saskaņā aprakstam punktā “Embriotransfērs” – skat.pielikumā;
  • atlikušo kvalitatīvo embriju vitrifikācija, ja embriju ir vairāk kā nepieciešams embriotransfēram. Vitrifikācijas procedūru veic saskaņā ar aprakstu izvērstā medicīniskā tehnoloģijā „Vitrifikācija” –skat.pielikumā.

3.2.11. Intracelulāra viena spermatozoīda injekcija olšūnā (ICSI vai fizioloģiskais ICSI).

3.2.11.1. Fizioloiskais ICSI veicams divos veidos – ar PICSI sistēmu un sperm-slow sistēmu, mainpulācija tiek realizēta atbilstoši attiecīgo testu veikšanai paredzēto medicīnisko ierīču lietošanas instrukcijai.

3.2.11.2. ISCI

  • Spermas iegūšana

- neinvazīvā ceļā;

- invazīvā ceļā – TESA, PESA mikroTESA.

  • Spermas sagatavošana un izolēšana atbilstoši metodes aprakstam izvērstā medicīniskā tehnoloģijā “Spermas sagatavošana” – skat.pielikumā.
  • Olšūnu iegūšana:

- superovulācijas stimulācija vai dabīgs cikls;

- olnīcu folikulu punkcija;

- olšūnas un kumulusa šūnu kompleksu skalošana un attīrīšana no folikulārā šķidruma.

  • Medicīniskā apaugļošana:

- Apaugļošanas platītes sagatavošanu vai fizioloģiskā ICSI platītes sagatavošana pēc olšūnu attīrīšanas, izmantojot iepriekš līdzsvarotus šķīdumus, atbilstoši šķīdumu ražotāja aprakstam;

- Spermatozoīdu izolēšana, izvēloties morfoloģiski normālus, kustīgus (ICSI) un nobriedušus (fizioloģiskais ICSI) spermatozoīdus;

- Intracitoplazmātiska mikroinjekcija olšūnā un viena spermatozoīda sapludināšana ar olšūnas citoplazmu;

  • Inkubācija (Kultivācija):

- Apaugļošanās jeb fertilizācijas novērtēšana (izvērtēšana) inversijas mikroskopā 16-20 stundas pēc procedūras (1. attīstības diena);

- Embriju novērtēšana (izvērtēšana) inversijas mikroskopā līdz 3. attīstības dienai:

- Embriju kultivācija var tikt prolongēta līdz blastocistu stadijai atbilstoši metodes aprakstam izvērstā medicīniskā tehnoloģijā “Blastocistu kultivācija” – skat.pielikumā;

  • Embriju atlase embriotransfēram;
  • Embriotransfērs (ET) – manipulācija tiek realizēta saskaņā aprakstam punktā “Embriotransfērs” – skat.pielikumā;
  • Atlikušo kvalitatīvo embriju vitrifikācija, ja embriju ir vairāk kā nepieciešams embriotransfēram. Vitrifikācijas procedūru veic saskaņā ar aprakstu izvērstā medicīniskā tehnoloģijā „Vitrifikācija” – skat.pielikumā.

3.2.12. Embriju transfērs (ET)

3.2.12.1. Pre-manipulācijas apraksts

- Dienu pirms paredzētā embriju transfēra tiek sagatavotas kultivācijas barotnes, kuras nepieciešamas transfēram.

- Stundu pirms embriju transfēra tiek izvēlēts kvalitatīvākais/-s embrijs/ -s transfēram un ievietots/ti speciālajā embriju transfēra kultivācijas barotnē.

- Tiek pārbaudīti pacientes personīgie dati,

- Paciente tiek sagatavota embrija/-u transfēram.

3.2.12.2. Manipulācijas apraskts

- Pacientei guļot uz ginekoloģiskā krēsla, veic ultraskaņas izmeklējumu, kura gaitā precizē dzemdes, cervikālā kanāla izmērus, endometrija biezumu.

- izvēlās piemērotāko embriju transfēra katetru, precizē tā izmērus un ievada embriju katetrā

- Pēc ginekoloģiskā spoguļa ievadīšanas sievietes makstī, veic dzemdes kakla apstrādi ar izotonisko šķīdumu.

- ultrasonogrāfjas kontrolē veic embrija/-u ievadīšanu dzemdes dobumā

- zem mikroskopa pārbauda katetru, lai apstiprinātu, ka embrijs/-i nav palicis/-kuši katetrā.

- Ja kāds embrijs ir palicis katetrā, procedūru atkārto.

- izņem ginekoloģisko spoguli no sievietes maksts.

3.2.12.3. Pēc-manipulācijas apraksts

- Pēc transfēra paciente 10 minūtes turpina atrasties guļus uz ginekoloģiskā krēsla miera stāvoklī.

- pēc embriju transfēra procedūras pacientei sniedz rekomendācijas par tālākajiem nozīmējumiem un režīmu pēc-transfera periodā.

4. Ārstniecības personas, viņu vispārējā un papildu kvalifikācija, kas nepieciešama MT realizācijai

- Ginekologs, dzemdību speciālists, kurš saņēmis apmācību olnīcu stimulācijas veikšanā ultrasonoskopijas un hormonālo izmeklējumu kontrolē, olnīcu punkcijā un embriju ievadīšanā dzemdē ultrasonoskopijas kontrolē;

- Urologs, kurš saņēmis apmācību vīrieša fertilitātes novērtēšanā veicot spermas analīzi, testis punkcijas veikšanā.

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju, kas apmācīts dzimumšūnu izolācijā, aktivācijā, apaugļošanā un embriju kultivēšanā in vitro , embriju sagatavošanā pārnešanai sievietes dzemdē, embriju sasaldēšanā un atkausēšanā.

- Medicīnas māsa,

- Vecmāte,

- Laborants.

5. MT tehnoloģiskais nodrošinājums

5.1. Ārstniecības līdzekļi

Lai nodrošinātu MT veikšanu, izmanto visdažādāko medicīnisko ierīču, zāļu (sedatīvi, narkozes un lokālās anestēzijas līdzekļi, u.c.), diagnostiskumu, instrumentu un palīgierīču kopumu. MT realizācijā var izmantot tikai likumīgi Latvijas tirgū ievietotus ārstniecības līdzekļus saskaņā ar to pielietošanu nosakošajiem normatīvajiem aktiem.

5.2. Specifiskās medicīniskās ierīces:

- ultraskaņas izmeklēšanas aparāts ar abdominālo un vaginālo zondi;

- ginekoloģiskais galds ar ginekoloģisko apskates lampu

- vaginālās zondes adapteris un marķētas adatas olnīcu folikulu punkcijai;

- folikulārā šķīduma aspirācijas sūknis

- laminārās plūsmas skapis ar filtrētu (sterilu) gaisa plūsmu un sildvirsmu;

- inkubators ar konrolētu gāzu padevi un temperatūras regulāciju;

- centrifūga;

- lupa (stereomikroskops) ar apsildāmu galdiņa virsmu;

- invertētais mikroskops ar maksimālo palielinājumu līdz 400 reizēm ar apsildāmu virsmu;

- mikroskops mikro-TESE veikšanai;

- gaismas mikroskops spermas apstrādei

- antivibrācijas galds, ja ārējās vides apstākļi to prasa;

- mikromanipulātors intracitoplazmātisku mikroinjekciju veikšanai;

- lāzers, digitālā video/foto kamera, dators ar speciālu programmatūru

- šķidrā slāpekļa uzglabāšanas un transporta trauki;

- sterili vienreizējas lietošanas plastmasas trauki un pipetes;

- automātiskās mikropipetes;

- sterili stikla un plastmasas kapilāri;

- aukstumiekārta sterilo kultivācijas un vitrifikācijas šķīdumu uzglabāšanai

5.3. Telpas un to aprīkojums

MT var tikt veikta tikai tādās stacionāro un ambulatoro ārstniecības iestāžu struktūrvienībās,

kuras atbilst un ir aprīkotas atbilstoši normatīvo aktu prasībām.

Medicīniskās apaugļošanas tehnoloģiju pielikums

Spermas sagatavošana

Ievads

Dabīgos apstākļos spermas plazma un tās komponenti palīdz spermatozoīdiem iziet cauri dabīgai barjerai - cervikālā kanāla gļotām. Medicīniskās apaugļošanas gadījumā tas varbūt nopietns šķērslis veiksmīgam apaugļošanās procesam. Grūtniecības iestāšanās rezultātus ar medicīniskās apaugļošanas tehnoloģijām var uzlabot, ja spermatozoīdi tiek attīrīti no spermas plazmas, citām šūnām un to sabrukšanas produktiem, kas atrodami ejakulātā. Attīrīšanas rezultātā tiek atlasīti morfoloģiski normāli un kustīgi spermatozoīdi augstā koncentrācijā.

Spermatozoīdu sagatavošanai medicīniskās apaugļošanas manipulācijām, ir aprakstītas vairākas metodes: spermas atmazgāšana, uzpeldināšanas (Swim-up) metode, blīvuma gradienta metode. Divas visplašāk izmantotās spermatozoīdu sagatavošanas metdes ir swim-up un gradienta centrifugācijas metodes.

Spermas sagatavošanas metodes izvēlē atkarīga no spermas materiāla kvalitātes. Swim-up tehnika tiek rekomendēta normospermijas gadījumā. Turpretīm blīvuma gradienta metode smagas oligozoospermijas,teratozoospermijas vai astenozoospermijas gadījumā.

Termini un skaidrojumi

◦ Apaugļošanās – spermatozoīda un olšūnas saplūšana, kad, saplūstot abu gametu ģenētiskajam materiālam, izveidojas zigota;

◦ Astenozoospermija – spermatozoīdu kustīgums ir zemāks par normatīvajām vērtībām (progresīvi kustīgie –mazāk kā 32%, progresīvi un neprogresīvi kustīgie –mazāk kā 40%);

◦ Embrijs – apaugļošanās produkts no apaugļošanās līdz embrioloģiskās stadijas beigām (astoņas nedēļas pēc apaugļošanās);

ICSI - Intracelulāra viena spermatozoīda injekcija olšūnā;

IVF - In-Vitro apaugļošana – medicīniskās apaugļošanas metode, kuru veic ārpus ķermeņa;

◦ Intrauterinā inseminācija – attīrītu spermatozoīdu ievadīšana sievietes dzimumceļos- makstī, cervikālā kanālā vai dzemdes dobumā;

◦ Jatrogēns – radies ārsta vai speciālista darbību, piemēram, ķirurģiskas iejaukšanās vai medikamentu lietošanas rezultātā;

◦ Oligozoospermija – spermatozoīdu koncentrācija ejakulātā mazāka kā 20 milj/ml vai spermatozoīdu daudzums kopējā ejakulātā <39 milj;

◦ Sperma – sēklas šķidrums, kurā atrodas spermatozoīdi;

◦ Spermatozoīds – vīrieša dzimumšūna;

◦ Teratozoospermija – vairāk kā 96 % patoloģiskas uzbūves spermatozoīdu klātbūtne ejakulātā VAI normālas uzbūves spermatozoīdu daudzums spermā mazāk kā 4 % );

◦ Zigota – apaugļota olšūna.

Spermas sagatavošanas priekšrocības un efektivitāte

Ir attīstītas dažādas spermas sagatavošanas metodes, kuru galvenais mērķis ir attīrīt kustīgo spermatozoīdu frakciju no spermas plazmas, leikocītiem, baktērijām, sabrukšanas produktiem, deģenerējušiem spermatozoīdiem un citām ejakulāta frakcijām, kas var negatīvi ietekmēt vēlamā rezultāta sasniegšanu kādā no medicīniskās apaugļošanas tehnoloģijām. Ikvienas medicīniskās apaugļošanas manipulācijas iznākums ir atkarīgs no spermatozoīdu kvalitātes, kas tiek izdalīti no ejakulāta. Ideālai spermatozoīdu sagatavošanas metodei medicīniskājā apaugļošanā jānodrošina morfoloģiski labāko dzīvo spermatozoīdu izdalīšanu no ejakulāta, minimālu spermas plazmas kontamināciju un jaizslēdz spematozoīdu bojājumu rašanos to sagatavošanas procesā.

Nosacījumi un iespējas spermas sagatavošanai

Indikācijas spermas sagatavošanai:

Nozīmēta neauglības ārstēšana ar kādu no ART metodēm:

· Intrauterīnā inseminācija (IUI),

· In-Vitro apaugļošana (IVF),

· Intracitoplazmatiskā spermatozoīda ievadīšana (ICSI)

· Fizioloģisks ICSI.

Spermas sagatavošanas potenciālie riski

Nepareizas metodes izmantošana, kā rezultātā iegūto spermatozoīdu daudzums un kvalitāte neatbilst pielietotās apaugļošanas metodes prasībām.

Metodes apraksts

Spermas atmazgāšanas metode

Metodes pamatā ir labas kvalitātes spermas atmazgāšana un koncentrēšana kultivēšanas vidē centrifugējot.

- Sašķidrinājušos spermas materiālu atšķaida ar kultivēšanas vidi un centrifugē. Izvēlētajai apaugļošanas procedūrai izmanto nogulsnes: sakoncentrēts spermas materiāls.

Swim-up metode :

Metodes pamatā ir kustīgu spermatozoīdu spēja izpeldēt no spermas palzmas kutivēšanas vidē, tādējādi tos attīrot no spermas plazmas un nekustīgiem spermatozoīdiem. Swim-up metodi var veikt, izmantojot sekojošas procedūras:

- koniskā centrifugēšanas stobriņā ieplidot sašķidrinājušos spermas materiālu un virs tā lēnām uzslāņo kultivēšanas vidi;

- koniskā centrifugēšanas stobriņā iepilda kultivēšanas vidi un zem tās lēnām iepilda sasšķidrinājušosa spermas materiālu.

Kustīgie spermatozoīdi uzpeld kultivēšanas vides slānī, kuru tālāk izmanto izvēlētajai apaugļošanas procedūrai.

Blīvuma gradienta metode :

Metodes pamatā ir spermas materiāla centrifugēšana ar bīvuma gradientu, kas atdala šūnas atkarībā no to blīvuma. Turklāt kustīgi spermatozoīdi aktīvi peld prom caur blīvuma gradientu slāni un veido nogulsnes stobriņa dibenā. Rezultātā tiek atadalīti kustīgie (aktīvie) spermatozoīdi no spermas plazmas satura (leikocīti, deģenerējuši spermatozoīdi, citas šūnas un sabrukšanas produkti).

- Blīvuma gradienta centrifugācijas metodes procedūru veic ievērojot izmantotās vides ražotāja instrukcijas un audu un šūnu centra standartprocedūru

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama spermas sagatavošanas procedūras veikšanai

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikta spermas sagatavošana

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums procedūras veikšanai un kurā veic visus nepieciešamos spermas sagatavošanas darbus.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas likumdošanas prasībām.

Medicīniskās iekārtas un materiāli

Pozīcija

Vienību daudzums

Laminārās plūsmas skapis, gb

1

Inkubators CO2 , gb

1

Laboratorijas krēsls, gb

1

Galds, gb

1

Skaitīšanas kamera ar segstiklu, gb

1

Centrifūga, gb

1

Laboratorijas skaitītajs, gb

1

Mikroskops ar x20, x40 objektīviem, gb

1

Automātiskā pipete 1-10µl, gb

1

Automātiskā pipete 100-1000µl, gb

1

Automātiskā pipete uzgaļi 1-10µl, gb

1

Automātiskā pipete uzgaļi 100-1000µl, gb

2

Seroloģisko pipešu sūknis, gb

5

Marķieris, gb

1

Spirts 70% ml, gb

1

Seroloģiskās pipetes 2ml, gb

2

Sterilas vienreizlietojamas Pastēra pipettes, gb

5

Centrifugācijas mēģenes 15ml, gb

5

Apaļdibena mēģenes 14ml, gb

3

Spermatozoīdu apstrādes vide, ml

3

Kultivacijas vide, ml

4

Blīvuma gradients, ml

1

Papīra salvetes, gb

4

Sejas maska, gb

5

Lateksa cimdi, gb

1

2

Aprēķinos nav iekļautas izmaksas par: telpu īri, elektroenerģiju, ventilācijas sistēmu un tās apkopi, IT sistēmas nodrošinājumu un programmatūrām, personāla atalgojumu, instrumentu dezinfekciju un sterilizāciju, telpu uzkopšanu, administartīvajiem izdevumiem (uzņemšana, grāmatvedība, kanceleja).

FIZIOLOĢISKAIS ICSI

Ievads

Ierīces darbības princps: Hialuronāns ir galvenais olšūnas uzkalnu (cumulus oophorus) aptverošās struktūras komponents. Nobrieduša spermatozoīda galvā ir hialuronānam atbilstošs receptors, kas nobriedušam spermatozoīdam ļauj piesaistīt hialuronānu. Turpretī nenobriedušie spermatozoīdi nepiesaistās. Nobriedušiem spermatozoīdiem piemīt augsta DNS virknes integritāte, normāla hromosomu aneuploīdiju frekvence, un tā nodrošina tādu vīrišķo ieguldījumu zigotā, kas pielīdzināms dabiskajā apaugļošanā pellucīda zonas piesaistītajai spermai.

Parastajā ICSI praksē spermatozoīdi injekcijām tiek atlasīti vizuāli, pamatojoties uz to morfoloģiju un kustīgumu. Tomēr šī pieeja neļauj noteikt spermas genoma viengabalainību un tās spēju nodrošināt vislabāko vīrišķo ieguldījumu zigotā. Fizioloģiskā ICSI procedūra nodrošina iespēju atlasīt nobriedušus spermatozoīdus, pamatojoties uz to spēju saistīties ar hialuronāna hidrogelu. Procedūra atdarina dabisko nobriedušo spermiju piesaisti olšūnas uzkalnam (cumulus oophorous), kas ir svarīgs atlases solis dabiskajā apaugļošanā.

Neauglīgo pāru ārstēšanā ar intracitoplazmas spermas injicēšanas metodi (ICSI), fizioloģiskā ICSI procedūra paredzēta, lai atlasītu nobriedušus un morfoloģiski pareizus spermotozoīdus injekcijai, kas piesaistījušies hialuronānam.

Priekšrocības un efektivitāte

- Ērta un viegli lietojama metode, nav nepieciešams papildus aprīkojums.

- Zemāki hromosomālo aneuploīdiju rādītāji.

- Zemāka DNS fragmentācija ar hialuronānu izvēlētu spermatozoīdu izmantošanā apaugļošanai.

- Zemāki agrīno spontāno abortu rādītāji.

Indikācijas

- Spermatozoīdu piesaiste hialuronānam (HBA tests) <80%.

- Hromosomu anomālijas – izmainīts kariotips vai apstiprināta ģenētiskā saslimšana.

- Paaugstināta spermatozoīdu DNS fragmentācija (DNS fragmentācijas tests).

- Zems apaugļošanās rādītājs iepriekšējā ciklā.

- Slikta embriju kvalitāte iepriekšējā ciklā.

- Atkārtoti agrīnie spontānie aborti.

- Vīrieša vecums > 45 gadiem.

- Neskaidras izcelsmes neauglība.

Kontrindikācijas

- Spermatozoīdu koncentrācija <15 milj/ml

- Spermatozoīdu kustīgums - progresīvi kustīgi spermatozoīdi >20%

Riski

Nobriedušu un morfoloģiski pareizu spermatozoīdu izvēle nenodrošina 100% apaugļošanās rezultātu, pilnīgi neizslēdz hromosomālu anomāliju iespējamību embrijā, kā arī nenodrošina visu embriju attīstību līdz blastocistas stadijai, tā kā šajā procesā tiek saņemta ģenētiskā informācija no oocīta, kas var būt ar hromosomālām izmaiņām, mitohondriālo nepietiekamību.

Darba gaita

Fizioloiskais ICSI veicams divos veidos – ar PICSI sistēmu un sperm-slow sistēmu, mainpulācija tiek realizēta atbilstoši attiecīgo testu veikšanai paredzēto medicīnisko ierīču lietošanas instrukcijai.

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama procedūras veikšanai

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikta fizioloģiskā ICSI procedūra

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums procedūras veikšanai.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas normatīvo aktu prasībām.

Aprēķinos nav iekļautas izmaksas par: telpu īri, elektroenerģiju, ventilācijas sistēmu un tās apkopi, IT sistēmas nodrošinājumu un programmatūrām, personāla atalgojumu, instrumentu dezinfekciju un sterilizāciju, telpu uzkopšanu, administartīvajiem izdevumiem (uzņemšana, grāmatvedība, kanceleja).

Blastocistu kultivācija

Ievads

Mūsdienās prolongēta embriju kultivācija in vitro apstākļos un blastocistu transfērs ir kļuvušas par neatņemamām sastāvdaļām reproduktīvajā ārstēšanā. Blastocistu kultivācija ļauj izvēlēties transfēram embrijus ar vislabāko attīstības potenciālu. Kopš pirmā IVF ceļā dzimušā bērna (1978. gadā), optimālais embriju transfēra veikšanas laiks ir bijis strīdīgs. Vēsturiski no IVF laikiem bija iegājies embriju transfēru veikt dalīšanās stadijas embrijiem (2. vai 3. attīstības diena). Lai gan šāda mērķtiecīga 2. vai 3. attīstības dienas embriju pārstādīšana tieši dzemdes dobumā tika atzīta par nefizioloģisku, nebija citu alternatīvu, jo nebija iespējams nodrošināt cilvēku embriju kultivāciju līdz blastocistas stadijai. Fizioloģiskos apstākļos 2-3 dienas vecs embrijs vēl atrodas olvados, kur apkartējās vides apstākļi un pieejamās barības vielas ievērojami atšķiras no apstākļiem, kādi tie ir dzemdes dobumā. Sasniedzot dzemdes dobumu, embrijs ir attīstījies līdz blastocistas vai morulas stadijai, kā rezultātā ir mainījušās arī embrijam nepieciešamās barības vielas. Musdienās, galvenokārt pateicoties laboratorijas tehnoloģiju uzlabojumiem, embrijus ir iespējams kultivēt līdz blastocistas stadijai, tādējādi nodrošinot fizioloģiskajiem apstākļiem maksimāli pietuvinātu embriju pāreju no inkubatora uz endometriju.

Termini un skaidrojumi

◦ Apaugļošanās – spermatozoīda un olšūnas saplušana, kad, saplūstot abu gametu ģenētiskajam materiālam, izveidojas zigota.

◦ Blastocista – embrijs, kuram ir izveidojies ar šķidrumu pildīts blastoceles dobums (parasti 5 - 6 dienas pēc apaugļošanās).

◦ Embrijs – apaugļošanās produkts no fertilizācijas līdz embrioloģiskās stadijas beigām.

◦ Embriju Transfērs – embriju ievadīšana sievietes dzemdes dobumā.

◦ Endometrijs – dzemdes iekšējais gļotādas slānis.

◦ ICSI – Intracelulāra viena spermatozoīda injekcija olšūnā.

In vitro – ārpus ķermeņa

◦ PGD – preimplantācijas ģenētiskā diagnostika

◦ PGS – preimplantācijas ģenētiskais skrīnings

Blastocistu kultivācijas priekšrocības un efektivitāte

Blastocistu kultivācijai in vitro apstākļos ir vairakas teorētiskas priekšrocības salīdzinot ar embriju transferiem, kas veikti 2. vai 3. attīstības dienā. Tās būtu:

[1] augstāks implantācijas rādītājs;

[2] samazināts pārstādāmo embriju daudzums;

[3] iespēja transfēram izvēlēties dzīvotspējīgākos embrijus;

[4] labāka embriju un endometrija sinhronizacija embriju transfēra laikā;

[5] ilgāks kultivācijas laiks nepieciešamības gadījumā dod iespēju veikt preimplantācijas ģenētisko dignostiku un/vai skrīningu (PGD/PGS).

Tā kā blastocistas stadiju sasniedz tikai potenciāli spējīgākie embriji, veicot blastocistas transfēru var maksimāli samazināt daudzaugļu grūtniecības iestāšanās risku, jo embriju transfēram var tikt izvēlēts tikai viens – spējīgākais embrijs. Vairākās publikācijās autori atzīst, ka blastocistu transfēru rezultāti, salīdzinot ar dalīšanās stadijas embriju transfēriem, ir līdzīgi vai pat augstāki.

Blastocistu kultivācijas nosacījumi un iespējas

Indikācijas blastocistas kultivācijai:

▪ Neveiksmīgi iepriekšējie cikli ar labas kvalitates embrijiem embriju 3. attīstības dienā;

▪ Sliktas kvalitātes sperma;

▪ Ja nepieciešams veikt viena embrija selekciju;

▪ Ja nepieciešams veikt PGD/PGS;

▪ Pacientēm ar hiperstimulācijas sindromu.

Kontrindikācijas blastocistas kultivācijai:

▪ Mazāk kā četri labas kvalitātes embriji to 3. attīstības dienā;

▪ Slikta embriju kvalitāte 3. attīstības dienā.

Blastocistu kultivācijas potenciālie riski

Blastocistu kultivācija un transfērs tiek saistīts ar vairākiem potenciālajiem riskiem. Tā kā nav izstrādāti universāli blastocistu attīstības prognozēšanas kritēriji, ir palielināts risks, ka, neskatoties uz normālu embriju attīstību 2. – 3. dienā, uz transfēru nebūs neviena embrija. Lai gan ir pierādījumi, kas liecina par to, ka blastomēru skaits un fragmentācijas pakāpe tieši korelē ar blastocistu attīstības potenciālu, tomēr spēja attīstīies blastocistai ievērojami atšķiras starp pacientiem, kas svārstās robežās no 0% līdz gandrīz 100%. Līdz ar to pacientiem, kuri piekrīt prolongētai embriju kultivācijai, ir jāapzinās ar to saistītās sekas un risks, ka embriju transfērs var tikt atcelts.

Veicot tikai viena embrija transfēru dzemdes dobumā, vienmēr saglabajas daudzaugļu grūtniecības risks, jo pat viena embrija transfērs neizslēdz monozigotisko dvīņu attīstīšanās iespēju. Tas pats arī ir attiecināms uz divu blastocistu transfēru, kurš tāpat kā 2. – 3. attīstības dienas embriju pārstādīšana, vienmēr saistās ar daudzaugļu grūtniecības risku.

Pacientiem, kuriem tiek veikta blastocistu kultivācija, ir lielāks risks, ka pēc transfēra būs mazāk embriju, kurus iespējams kriosaglabāt, nekā tas būtu, veicot 2. vai 3. dienas embriju transfēru. Tāpat vienmēr pastāv risks, ka embriju priekš kriosaglabāšanas nebūs.

Metodes apraksts

- Visas kultivācijas barotnes jāsagatavo pēc ražotāja instrukcijas.

- Olšūnas pēc ICSI manipulācijas tiek ievietotas kultivācijas barotņu pilienos, kas pārklāti minerāleļļu.

- Veicot IVF apaugļošanu, olšūnas uz pilieniem pārliek nākamajā dienā pirms apaugļošanās novērtēšanas.

- Apaugļošanos novērtē pēc 16 - 20 stundām.

- Otrajā dienā novērtē embriju pirmo dalīšanos.

- Trešajā dienā novērtē embriju otro dalīšanos, pārliek embrijus jaunās platēs, kurās pielieniem izmantota kultivācijas vide, kas īpaši paredzēta blastocistu kultivācijai. Alternatīvi: ja kultivāciju veic nepārtrauktas kultivācijas vidē, embriju pārlikšana uz platēm ar jaunu kultivācijas vidi neveic, t.i.embrijus nepārtrauktās kultivacijas vidē kultivē līdz tie sasniedz vēlamo attīstības stadiju.

- Ceturtajā dienā novērtē embriju tālāko attīstību.

- Ceturtajā dienā novērtē embriju tālāko attīstību.

- Embriju kultivāciju veic līdz piektajai/sestajai attīstības dienai, kad veic embriju transfēru - embriju/-us ievada sievietes dzemdes dobumā.

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama blastocistu kultivacijai

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikta blastocistu kultivācija

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehniskais nodrošinājums procedūras veikšanai un kurā veic visus nepieciešamos darbus blastocistu kultivācijas nodrošināšanai.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas likumdošanas prasībām.

Medicīniskās iekārtas un materiāli

Pozīcija

Vienību daudzums

Laminārās plūsmas skapis, gb

1

Stereomikroskops, gb

1

Inkubators CO2 , gb

1

Gāzes sistēma inkubatoram ar CO2 balonu, gb

1

Mikroskops-mikromanipulātors, gb

1

Laboratorijas krēsls, gb

1

Seroloģisko pipešu sūknis, gb

1

Flex pipete, gb

1

Mikropipete 10-100µl, gb

1

CO2 (AGA), L

1

Flex pipetes uzgaļi,gb

2

Seroloģiskās pipetes 10ml, gb

2

Mikropipetes uzgaļi 100µl, gb

2

Petri plates, gb

2

Kultivacijas vide Day0-3, ml

2

Kultivacijas vide Day3-5, ml

1

Nepārtrauktās kultivācijas vide, ml

1

Minerāleļļa, ml

14

Cepurīte, gb

2

Sejas maska, gb

2

Lateksa cimdi, gb

4

Aprēķinos nav iekļautas izmaksas par: telpu īri, elektroenerģiju, ventilācijas sistēmu un tās apkopi, IT sistēmas nodrošinājumu un programmatūrām, personāla atalgojumu, instrumentu dezinfekciju un sterilizāciju, telpu uzkopšanu, administartīvajiem izdevumiem (uzņemšana, grāmatvedība, kanceleja).

“Assisted hatching”

Ievads

Zona Pellucida (ZP) ir olšūnas glikoproteīnu apvalks, kas raksturīgs visām zīdītāju olšūnām. ZP ir nozīmīga loma olšūnu apaugļošanās procesā kā arī embrija attīstībā. Kad embrijs ir sasniedzis blastocistas stadiju, tas pārplēš ZP. Pa izveidoto atveri embrijs iziet no ZP. Embrijam ir jāiziet no ZP, lai trofektodermas šūnas varētu mijiedarboties ar endometrija šūnām, veicinot embrija implantāciju. Embrija implantācija nav iespējama, ja tas dažādu faktoru dēļ nespēj pārplēst ZP un iziet no tās.

“Assisted hatching” (AH) jeb embrija sagatavošana ievadīšanai dzemdes dobumā ir palīgmetode, ar kuras palīdzību izveido ZP atveri vai paplānina ZP biezumu, lai atvieglotu blastocistas iziešanu no ZP un sekmētu embrija implantāciju.

AH iespējams veikt trīs dažādos veidos – izmantojot lāzera staru, mehāniski pāršķeļot ZP, kā arī ķīmiski izšķīdinot ZP membrānā iedobi.

Indikācijas procedūrai:

1. Zonas Pellucidas biezums vairāk kā 15 µm;

2. Sievietes vecumus > 38 gadiem;

3. Embriji vai embrijs ir ticis vitrificēts vai saldēts;

4. Procedūrai izmantotas vitrificētas olšūnas;

5. Zema embriju kvalitāte;

6. Blastocista vēl nav sākusi iziet no ZP, vai ir iesākusi iziet un iesprūdusi;

7. Iepriekšējas embriotransfēru (ET) procedūras, pēc kurām nav iestājusies gūtniecība;

8. Blastocistām, kuras pirms saldēšanas nepieciešams kollapsēt.

Embrija apvalka mehāniska atvēšana

Uzstāda mikromanipulatoram pipetes, mikroinjekcijas pipetes vietā lieto Partial Zona Dissection Pipetti. No embriju kultivācijas plates pārnes ET izvēlētos embrijus uz sagatavoto embrija apvalka atvēršanas plati un novieto to uz mikromanipulātora. Ar mikropipetes (Partial Zona Dissection Pipette) palīdzību izveido ZP atveri- V vai X veida. Atvērumam embrija ZP ir jābūt pietiekoši lielam, lai pa to varētu iziet blastocista, kā arī pietiekoši mazam, lai pa to netiktu pazaudēti blastomēri, ja AH tiek veikts pirms embrija kompaktizācijas sākuma.

Embrija apvalka atvēršana izmantojot lāzeri

Uzstāda mikromanipulatoram holdinga pipeti un ieslēdz lāzera datorprogrammu. No embriju kultivācijas plates pārnes ET izvēlētos embrijus uz sagatavoto embrija apvalka atvēršanas plati un novieto to uz mikromanipulātora. Embriju pietur ar holdinga pipetes palīdzību un izvēlas vietu lāzera stara šāvienam. Veic embrija apstrādi ar lāzeru izvēlētajā vienā vai vairākos punktos.

Embrija apvalka ķīmiska atvēršana (acid Tyrode)

No embriju kultivācijas plates pārnes ET izvēlētos embrijus uz sagatavoto embrija apvalka atvēršanas plati un novieto to uz mikromanipulātora. Ar mikropipeti, kurā atrodas skābe, izveido ZP iedobumu, pilnībā neizsķīdinot ZP. Skābe nedrīkst iekļūt embrijā. Pēc AH procedūras embriju vairākas reizes skalo IVF šķīdumā un tad pārnes uz ET plati.

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama AH veikšanai

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikta AH procedūra

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums procedūras veikšanai.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas normatīvo aktu prasībām.

Reaģenti (vides):

1. Liquid Paraffin 6 ml

2. Flushing medium 1 ml

3. IVF 1 ml

4. Acid Tyrode 0,5 ml

5. Tālāka barotne embrija transfēram 4 ml

Iekārtas un instrumentārijs

Mikromanipulators ar sildvirsmu 370C , gb

1

Invertētais mikroskops, gb

1

Stereomikroskops ar sildvirsmu 370C, gb

1

Inkubators 370C, 5,5%CO2 , gb

1

Pre-mix gāzes inkubators, gb

1

Laminārs, aprīkots ar silto galdu, gb

1

Holdinga Pipette, gb

1

Partial Zona Dissection Pipette, gb

1

Assisted Hatching micropipete, gb

1

Stripper Pipette, gb

1

Automātiskā pipete, gb

1

Lāzers, gb

1

Foto/video kamera, gb

1

Dators ar specializētu datorprogrammu, gb

1

IVF platīte, gb

2

Stripper pipetes uzgaļi, gb

2

Seroloģiskās pipetes, gb

5

Sterila, ventilējama 14 ml apaļdibena mēģene, gb

2

Embriju transfērs

Ievads

Embriju transfērs ir pēdējais un viens no kritiskākajiem in vitro apaugļošanas posmiem, kurš lielā mērā nosaka neauglības ārstēšanas iznākumu. Lielākā daļa pāru, kuriem veic medicīnisko apaugļošanu, nonak līdz embriju transfēra procedūrai, taču ne visiem pāriem iestājas grūtniecība. Implantācijas rādītājus tieši ietekmē gan embriju kvalitāte, gan embriju transfēra tehnika. Divi no galvenajiem embriju transfēra iznakumu ietekmējošajiem faktoriem ir augsta embriju kvalitāte un endometrija uzņēmība; tomēr zemas kvalitātes embriju transfēra tehniskais izpildījums, bieži ir galvenais cēlonis neveiksmīgai embriju implantācijai. Galvenie embriju transfēra izpildījuma kvalitati ietekmējošie faktori ir;

- embriju transfēra sarežģītība,

- asiņu klātbūtne uz transfēra katetra,

- izmantotā katetra veids,

- transfēra veikšanai izmantotā metodika

- reproduktologa profesionalitāte un pieredze.

Tikai precīza embriologa un reproduktologa sadarbība sekmē veiksmīgu embriju transfēra norisi.

Viens no galvenajiem nosacījumiem, lai nodrošinātu kvalitatīvu embriju transfēra izpildījumu, ir transfēra veikšana abdominālās ultrasonogrāfijas kontrolē. Kontrolēta embriju transfēra norise samazina traumatiska transfēra iespējamību, nodrošina precīzu embriju ievadīšanu attiecībā pret endometriju un palielina implantācijas rādītājus.

Termini un skaidrojumi

· Embrijs – apaugļošanās produkts no fertilizācijas līdz embrija/-u transfēram.

· Embrija/-u transfērs – embrija/-u ievadīšana sievietes dzemdes dobumā.

· Endometrijs – dzemdes gļotādas slānis.

· In vitro – ārpus ķermeņa.

· IVF in vitro apaugļošana.

Embriju transfēra priekšrocības

Galvenā embriju transfēra priekšrocība ir tā, ka pacientiem ir iespēja izvelēties parstādāmo embriju daudzumu. Veicot embriju tranfēru trešajā vai piektajā embriju attīstības dienā, ir iespējams transfēram izvēlēties piemērotāko/-s, kvalitatīvāko/-s embriju/-s. Veicot sasaldēto embriju transfēru, iespējama precīza endometrija sinhronizācija ar embriju transfēra dienu.

Embriju transfēra nosacījumi un iespēja s

Kontrindikācijas embriju transfēram:

▪ Vidēji smags/smags olnīcu hiperstimulācijas sindroms;

▪ Asiņošana no dzimumceļiem;

▪ Endometrija neatbilstība;

▪ Neatbilstoša embriju kvalitāte;

▪ Pēkšņa pacientes veselības stāvokļa pasliktināšanās pirms plānotā embriju transfēra.

Embriju transfēra potenciālie riski

Veicot embriju transfēru dzemdes dobumā, vienmēr, neatkarīgi no pārstādīto embriju skaita, saglabajas daudzaugļu grūtniecības risks, jo pat viena embrija transfērs neizslēdz monozigotisko dvīņu attīstīšanās iespēju. Tā kā embriju transfērs ir medicīniska manipulācija, ar to saistītie potenciālie riski var būt:

  • ārpusdezemdes grūtniecība;
  • asiņošana;
  • infekcijas.

Metodes apraksts

Pre-manipulācijas apraksts

- Dienu pirms paredzētā embriju transfēra embriologs sagatavo kultivācijas barotnes, kuras nepieciešamas transfēram.

- Stundu pirms embriju transfēra embriologs izvēlas kvalitatīvāko/-s embriju/ -s transfēram un ievieto to/-s speciālajā embriju transfēra kultivācijas barotnē.

- Pirms maniplācijas medmāsa vai vecmāte pārbauda pacientes personīgos datus,

- Medmāsa vai vecmāte veic pacientes sagatavošanu embrija/-u transfēram.

Manipulācijas apraskts

- Pacientei guļot uz ginekoloģiskā krēsla, ārsts-ginekologs veic ultraskaņas izmeklējumu, kura gaitā precizē dzemdes, cervikālā kanāla izmērus, endometrija biezumu.

- Ārsts-ginekologs izvēlās piemērotāko embriju transfēra katetru. Precizē izmērus.

- Katetrs tiek nodots embriologam embrija/-u ievadīšanai katetrā.

- Pēc ginekoloģiskā spoguļa ievadīšanas sievietes makstī, ārsts- ginekologs veic dzemdes kakla apstrādi ar izotonisko šķīdumu.

- Ārsts- ginekologs dod komandu embriologam par embrija/-u ievilkšanu katetrā.

- Embriologs izskalo tranfēra katetru ar embriju transfēra kultivācijas barotni.

- Embriologs izņem embriju/-s no inkubatora, veic embrija/-u ievilkšanu katetrā un nodod katetru ārstam- ginekologam.

- Ārsts – ginekologs ultrasonogrāfjas kontrolē veic embrija/-u ievadīšanu dzemdes dobumā un nodod katetru atpakaļ embriologam.

- Embriologs zem mikroskopa pārbauda katetru, lai apstiprinātu, ka embrijs/-i nav palicis/-kuši katetrā.

- Ja kāds embrijs ir palicis katetrā, procedūru atkārto.

- Ja viss kārtībā, ārsts-ginekologs izņem ginekoloģisko spoguli no sievietes maksts.

Post-manipulācijas apraksts

- Pēc transfēra paciente 10 minūtes turpina atrasties guļus uz ginekoloģiskā krēsla miera stāvoklī.

- Ārsts –ginekologs pēc embriju transfēra procedūras pacientei sniedz rekomendācijas par tālākajiem nozīmējumiem un režīmu pēc-transfera periodā.

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama embriju transfēra veikšanai

- Ārsts - ginekologs.

- Medmāsa vai vecmāte.

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikts embriju transfērs

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehniskais nodrošinājums procedūras veikšanai.

- Manipulāciju kabinets, kas atbilstoši aprīkots.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas likumdošanas prasībām.

Medicīniskās iekārtas un materiāli

Pozīcija

Vienību daudzums

Ultraskaņas aparāts ar vaginālu un abdominālu uzgali, gb

1

Laminārās plūsmas skapis, gb

1

Stereomikroskops, gb

1

Inkubators CO2 , gb

1

Gāzes sistēma inkubatoram ar CO2 balonu, gb

1

Ginekoloģiskais galds, gb

1

Laboratorijas krēsli, gb

2

Galds medicīnas instrumentiem, gb

1

Apskates lampa, gb

1

Seroloģisko pipešu suknis, gb

1

Flex pipete, gb

1

Vaginālais spogulis, gb

1

Pincete, gb

1

Spilvens ar spilvendrānu, gb

1

Sterilie tamponi, gb

10

Prezervatīvs vaginālajai zondei, gb

1

Embriju transfēra katetrs, gb

1

Trauks izotoniskajam šķīdumam, gb

1

Izotoniskais šķīdums, ml

50

USG gēls, ml

10

Flex pipetes uzgaļi, gb

1

Seroloģiskās pipetes 2ml, gb

1

Seroloģiskās pipetes 10ml, gb

1

IVF plates, gb

2

Šļirce 1ml, gb

1

Embriju transfēra kultivacijas vide, ml

1,5

PBS buferis, ml

7

Vienreizējas lietošanas halāts, gb

1

Papīra salvetes, gb

10

Papīra pārklājs, gb

5

Sterili cimdi, gb

2

Cepurītes, gb

2

Sejas maska, gb

2

Aprēķinos nav iekļautas izmaksas par: telpu īri, elektroenerģiju, ventilācijas sistēmu un tās apkopi, IT sistēmas nodrošinājumu un programmatūrām, personāla atalgojumu, instrumentu dezinfekciju un sterilizāciju, telpu uzkopšanu, administartīvajiem izdevumiem (uzņemšana, grāmatvedība, kanceleja).

Vitrifikācija

Ievads

Kriosaglabāšanai in vitro apaugļošanas sfērā ir vairākas svarīgas nozīmes. Galvenais kriosaglabāšanas mērķis medicīniskās apaugļošanas tehnoloģijās ir nodrošināt augstus pacientu embriju izdzīvošanas un dzīvotspējas rādītājus pēc atkausēšanas procedūras.

Vitrifikācija ir kriosaglabāšanas metode, kuras pamatā ir vitrifikācijas šķīdumu ar augstu krioprotektantu koncentrāciju izmantošana un ātra bioloģiskā materiāla vitrificēšana tieši šķidrajā slāpeklī. Tādējādi vitrifikācijas process, kura laikā oocīti un embriji tiek atdzesēti, notiek dažu sekunžu laikā. Fizikālā vitrifikācijas definīcija ir – uz ūdens bāzēta šķīduma sacietēšana super-zemā temperatūrā, kuras laikā šķīdums pārvēršas caurspīdīgā, stiklveida, bez-ledus masā, neveidojot ledus kristālus. Vitrifikāciju var sadalīt trīs gavenajos posmos:

1. šūnu ekvilibrācija – kuras laikā šūnās esošais ūdens tiek aizvietots ar krioprotektantiem,

2. dehidratācija – kad no šūnām tiek izvilkts vēl palikušais ūdens, kam seko bioloģiskā materiāla uznešana uz krionesēja;

3. vitrifikācija (iegremdēšana šķidrajā slāpeklī -196°C) – kuras pamatā ir nevis sasalšanas process, bet ārkārtīgi strauja viskozitātes palielināšanās.

Atdzišanas ātrums, kāds tiek sasniegts vitrifikācijas procesā, svārstās no 15000 līdz 30000°C/min, tādējādi ūdens no šķidrās fāzes momentāni tiek pārvērsts sliklainā, vitrificētā stāvoklī. Pielietojot šo kriosaglabāšanas metodi, neveidojas ledus kristāli, kas var bojāt šūnas.

Literatūrā ir aprakstīti veiksmīgi dažādu bioloģisko materiālu vitrificēšanas gadījumi, bet medicīniskās apaugļošanas nozarē vislielākā uzmanība tiek pievērsta oocītu, zigotu, embriju un blastocistu vitrificēšanai. Pēdējos gados vērojāmā pastiprinātā metodes izmantošana medicīniskās apaugļošanas nozarē, ir veicinājusi strauju vitrifikācijas tehnoloģijas attīstību.

Termini un skaidrojumi

· Blastocista – embrijs, kuram ir izveidojies ar šķidrumu pildīts blastoceles dobums (parasti 5-6 dienas pēc apaugļošanās);

· Embrijs – apaugļošanās produkts no apaugļošanās līdz embrioloģiskās stadijas beigām (astoņas nedēļas pēc apaugļošanās);

· Embriju transfērs – embriju ievadīšana sievietes dzemdes dobumā;

· In vitro – ārpus ķermeņa;

· Lēnā sasaldēšana – sasaldēšanas metode, kas balstās uz pakāpensisku, kontrolētu temperatūras samazināšanu.

· Oocīts – sievišķā dzimumšūna;

· Vitrifikācija – ātra sasaldēšanas metode, kuras laikā neveidojas ledus kristāli.

· Zigota – diploīda šūna, kas rodas spermatozoīdam apaugļojot olšūnu.

Vitrifikācijas priekšrocības un efektivitāte

Galvenā vitrifikācijas tehnoloģijas priekšrocība ir tā, ka tā ir vienkārša kriosaglabāšanas metode, kuras veikšanai nav nepieciešamas dārgas un sarežģītas iekārtas un pati vitrifikācijas procedūra neprasa daudz laika.

Vitrifikācijas efektivitāte ir pierādīta neskaitāmās publikācijās, kur, salīdzinot ar lēnās sasaldēšanas metodi, ir sasniegti daudz augstāki izdzīvošanas, implantācijas un klīnisko grūtniecību iestāšanās rezultāti visās embriju attīstības stadijās- sākot no zigotas un beidzot ar blastocistu. Vitrifikācijas augstie izdzīvošanas rādītāji ir veicinājuši metodes ieviešanu praksē, ļaujot samazināt pārstādīto embriju skaitu vienā transfērā, tādējādi samazinot daudzaugļu grūtniecību iestāšanas gadījumu skaitu. Tomēr galvenais vitrifikācijas pielietojums tiek saists ar pēc embriju transfēra pāri palikušo labas kvalitātes embriju kriosaglabāšanu, kas pacientiem sniedz iespēju veikt ārstēšanu nākotnē, veicot tikai daļu no visām dārgajām manipulācijām. Tāpat vitrifikācija kļuvusi par neatņemamu sastāvdaļu cīņā ar hiperstimulācijas sindromu, kad tiek atcelts embriju transfērs un tiek kriosaglabāti visi embriji.

Nosacījumi un iespējas vitrifikācijai

Indikācijas vitrifikācijai:

▪ Nepieciešamība saglabāt oocītus pēc olnīcu punkcijas.

▪ Pēc embriju transfēra palikuši pāri labas kvalitātes embriji.

▪ Atcelts embriju transfērs.

▪ Hiperstimulācijas sindroms.

▪ Ētiski, reliģiski vai sociāli apstākļi.

Kontrindikācijas vitrifikacijai:

▪ Ētiski, reliģiski vai sociāli apstākļi.

Vitrifikācijas potenciālie riski

Vitrifikācijas procesā ir vairāki faktori, kas var būtiski ietekmēt metodes rezultātus:

[1] krioprotektanta veids un koncentrācija (praktiski, visi krioprotektanti ir toksiski),

[2] vitrifikācijas šķīdumu temperatūta procedūras laikā,

[3] ekspozīcijas ilgums, kuru oocīti un embriji tiek noturēti pēdējā krioprotektantu šķīdumā pirms iegremdēšanas šķidrajā slāpeklī,

[4] krionesēju veids un materiāls,

[5] oocītu kvalitāte;

[6] embriju kvalitāte un attīstības stadija,

[7] personāla kvalifikācija.

Tā kā visām šūnām ir bioloģiskās tolerances robeža, kas nosaka, cik lielu krioprotektanta koncentrāciju šūnas spēj izturēt, galvenā problēma vitrifikācijas metodes pielietošanā ir nepieciešamība lietot šķīdumus ar augstām krioprotektantu koncentrācijām. Tāpēc katra vitrifikācijas protokola mērķis ir palielināt temperatūru maiņas ātrumu, paralēli saglabājot krioprotektantu koncentrācijas pēc iespējas zemākas.

Neskatoties uz literatūrā aprakstītajiem augstajiem pēc-vitrifikācijas izdzīvošanas rezultātiem, neviena kriosaglabāšanas metode nevar pilnība garantēt 100% labu atkausētu oocītu kvalitāti vai 100 % embriju izdzīvošanu - katram embrijam ir savs ģēnētiskais materiāls, kas nosaka tā individuālo toleranci pret ārējiem kairinātājiem. Tādējādi pacientiem ir jaapzinās potenciālie kriosaglabāšanas riski un jabūt informētiem par iespējamiem negatīviem atkausēšanas rezultātiem.

Metodes apraksts

Vitrifikācija

- Vitrifikācijas procedūru veic stingri ievērojot ražotāja instrukcijas.

- Kriosaglabātā materiāla uzglabāšana atbilstoši prasībām/standatprocedūrām.

Vitrifikācijas atkausēšana

- Vitrifikācijas atkausēšanas procedūru veic stingri ierovērojot ražotāja instrukciju.

- Embriju kultivācija- atbilstoši prasībām/standartprocedūrām.

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama vitrifikācijas veikšanai

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikta vitrifikācija

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums procedūras veikšanai.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas normatīvo aktu prasībām.

Medicīniskās iekārtas un materiāli

Pozīcija

(iekārtas, materiāli un to nepieciešamie daudzumi atkarīgi no izmantotā vitrifikācijas protokola/ražotāja)

Vienību daudzums

Laminārās gaisa plūsmas skapis, gb

1

Stereomikroskops x10 x (x0.8 – x8) ar sildvirsmu, gb

1

Inkubators +37°C; 5% O2, 6% CO 2, vai 6% CO2, gb

1

Transporta djuārs, gb

1

Kriouzglabāšanas djuārs, gb

3

Djuārs LN2 uzglabāšanai, gb

1

Kaste šķidrajam slāpeklim, gb

1

Pipete embriju pārnešanai, gb

1

Embrioloģiskais krēsls, gb

1

Pincete, gb

1

Strāzu grieznes/knaibles, gb

1

Taimeris, gb

1

Ūdensizturīgs marķieris, gb

1

Mikropipete, gb

1

Metāla krisalmiņu turētājs, gb

1

Plastmasas kriosalmiņu turētājs, gb

1

Mikropipetes uzgaļi 10-1000µl, gb

6

Šķidrais slāpeklis, L

3

Sejas maska, gb

1

Lateksa cimdi, gb

2

Vitrifikācijas vide Cooling (atkarīgi no protokola) (ml) vai Vitrifikācijas vide atkausēšanai Warming,ml

1

4-bedrīšu plate vai Warming plate (atkarīgi no protokola) , gb

1

Embriju nesējs cryotec (atkarīgi no protokola) , gb

1

Invertais mikroskops x10 x (x4 – x20) ar sildvirsmu, gb (atkausēšanai)

1

Embriju/olšūnu kultivācijas vide, ml (atkausēšanai)

6

Petri plates 35x10, gb (atkausēšanai)

1

IVF plate 60x15, gb (atkausēšanai)

1

Aprēķinos nav iekļautas izmaksas par: telpu īri, elektroenerģiju, ventilācijas sistēmu un tās apkopi, IT sistēmas nodrošinājumu un programmatūrām, personāla atalgojumu, instrumentu dezinfekciju un sterilizāciju, telpu uzkopšanu, administartīvajiem izdevumiem (uzņemšana, grāmatvedība, kanceleja).

In vitro nobriedināšana (IVM)

Ievads

Oocītu in vitro nobriedināšana (turpmāk IVM – starptautiski pieņemts apzīmējums – In Vitro Maturation) ir viena no medicīniskās apaugļošanas metodēm, kuras pamatā ir agrīnas stadijas oocītu kultivēšana IVM vidē ar pievienotu gonadotropīnu (cHG) un folikulu stimulējošo hormonu (FSH), līdz metafāzes II stadijai, iegūstot nobriedušas sievišķās dzimumšūnas. Tās turpmāk var izmantot medicīniskai apaugļošanai vai uzglabāt kriokonservējot (vai vitrificējot).

Vēsturiski šī metode ir zināma kopš 1960.-tiem gadiem, kad R.Edvards ( R. Edward) pirmo reizi parādīja, ka šo metodi ir iespējams pielietot ne tikai dzīvnieku, bet arī cilvēka oocītu nobriedināšanai. Pēc literatūras datiem, pirmā grūtniecība, kas iestājusies izmantojot nestimulētus nobriedinātus oocītus ir notikusi 1991. gadā.

Metodes galvenie soļi ir:

[1] nenobriedušu oocītu iegūšana no nestimulētām vai vidēji stimulētām olnīcām, vai olnīcu audiem;

[2] oocītu kultivēšana IVM vidē;

[3] oocītu nobriešanas pakāpes noteikšana mikroskopējot;

[4] iegūto nobriedušo oocītu izmantošana medicīniskajai apaugļošanai vai uzglabāšana sasaldējot.

Literatūrā minētas vairākas pacienšu grupas, kurām var un būtu ieteicams izmantot oocītu nobriedināšanu in vitro, tomēr divas galvenās grupas ir:

[1] pacientes ar policistisko olnīcu sindromu (PCOS) vai olnīcu hiperstimulācijas sindromu;

[2] onkoloģisko saslimšanu pacientes pirms gonadotoksiskas terapijas, kas var būtiski pasliktināt sievietes turpmāko reproduktīvās sistēmas darbību.

Pēdējos gados vērojama tendence izmantot šo metodi tieši pacientēm ar PCOS, kā arī pacientēm pirms onkoloģisko saslimšanu ārstēšanas kursa. Šī interese par IVM arī stimulē pētījumus metodes efektivitātes uzlabošanai.

Termini un skaidrojumi

◦ cFSH – cilvēka folikulu stimulējošais hormons.

◦ cHG – cilvēka horiona gonadotropīns.

◦ ICSI – Intracelulāra viena spermatozoīda injekcija olšūnā.

In vitro – ārpus ķermeņa.

IVF In vitro apaugļošana – ārpus ķermeņa apaugļošana

IVMin vitro nobriedināšana (starptautiski pieņemts apzīmējums – In Vitro Maturation).

◦ PCOS – policistisku olnīcu sindroms.

IVM priekšrocības un efektivitāte

Galvenā IVM tehnoloģijas priekšrocība ir tā, ka to ir iespējams izmantot sievietēm, kurām medicīnisku apstākļu dēļ iegūt nobriedušus oocītus nav iespējams. Otra priekšrocība ir tā, ka tā ir salīdzinoši ātra, kas neprasa daudz laika.

IVM efektivitāte (iegūti nobrieduši, apaugļojami oocīti) ir pētīta vairākās publikācijās, kur tā ir starp 20 – 40%, tomēr tā joprojām nav tik sekmīga kā IVF vai ICSI, tādēļ tā tiek izmantota kā otrās līnijas terapija.

Efektivitātes uzlabošanai, joprojām notiek pētījumi, kuros tiek pārbaudītas dažādas IVM vides piedevas, un dažādi oocītu inkubēšanas laiki, kā arī salīdzināts grūtniecību iestāšanās skaits pārnesot svaigi nobriedinātus embrijus un sasaldētus embrijus.

IVM nosacījumi un iespējas

IVM Indikācijas:

  • Pacientēm ar PCOS.
  • Pacientēm ar hiperstimulācijas sindromu.
  • Pacientēm ar onkoloģiskām saslimšanām pirms gonadotoksiskas terapijas uzsākšanas.
  • Ētiski, reliģiski vai sociāli apstākļi.

IVM Kontrindikācijas:

  • Ētiski, reliģiski vai sociāli apstākļi.

IVM potenciālie riski

Galvenie riski šajā procesā ir tieši oocītu ieguves laikā. Nenobriedušus oocītus iespējams iegūt no pacientēm ar PCOS vai hiperstimulācijas sindromu, kā arī no pacientēm ar onkoloģiskām saslimšanām pirms terapijas uzsākšanas. Parasti tā ir olnīcu punkcija, bet bieži nenobriedušus oocītus iespējams izdalīt no laparoskopiski iegūtiem olnīcu audiem, pirms to sasaldēšanas (turpmākai uzglabāšanai).

IVM procesā ir vairāki faktori, kas var ietekmēt sekmīgu oocītu nobriešanu:

[1] oocītu praimēšana (ja tādu veic ar cHG vai cFSH);

[2] cHG un cFSH izmantošanas devas nepraimētu oocītu nobriedināšanai in vitro;

[3] dažādas IVM vides, kas galvenokārt sastāv no dažādiem elementiem t.sk. augšanas faktoriem un steroīdiem;

[4] oocītu inkubēšanas laiks IVM vidē;

[5] oocītu kvalitāte;

[6] personāla kvalifikācija.

Apokopjot datus par 200 bērniem, kas dzimuši izmantojot IVM oocītus, netika konstatētas galvenās iedzimtās anomālijas, savukārt 2015.g. publicētā pētījumā parādīts, ka IVM procedūra nav saistīta ar epiģenētiskām izmaiņām (DNS metilēšanas paterniem) bērnos, kas dzimuši pēc ICSI vai IVF procedūru izmantošanas.

Neskatoties uz literatūrā aprakstītajiem IVM metodes efektivitātes uzlabojumiem, iestājušos grūtniecību skaits izmantojot IVM nobriedinātus oocītus ir zemāks vai tuvu, bet ne lielāks, kā konvencionālām medicīniskās apaugļošanas metodēm, kurās izmanto in vivo nobriedinātus oocītus. Oocītu nobriedināšana ārpus organisma nevar 100% nodrošināt sekmīgu iznākumu, tomēr tā ir iespēja noteiktām pacientu grupām veikt medicīnisko apaugļošanu, izmantojot IVM. Pacientiem ir jābūt informētiem par iespējamiem negatīviem rezultātiem, piemēram, ka iegūtie oocīti tomēr nesasniedz apmierinošu nobriešanas stadiju.

Metodes apraksts

  • IVM procedūru veic stingri ievērojot ražotāja noteikto lietošanas instrukciju.
  • Galvenie IVM procedūras posmi:

- Oocītu inkubēšana IVM vidē ar pievienotiem cHG un FSH (IVM vides var būt vairākas) no 28 – 32h, bet ne ilgāk kā 42 h +37 °C, 5% CO2 inkubatorā.

- Oocītu nobriešanas pakāpes noteikšana mikroskopējot.

  • Oocītu IVM veic atbilstoši prasībām/standartprocedūrām.

Ārstniecības personas un viņu kvalifikācija, kas nepieciešama IVM veikšanai

- Laboratorijas ārsts vai biologs ar embriologa kvalifikāciju.

Informācija par telpām, kurās tiek veikta IVM

- IVF klīnikas laboratorija – telpa, kurā ir nepieciešamais tehnoloģiskais nodrošinājums procedūras veikšanai.

- Telpām jāatbilst Latvijas Republikas normatīvo aktu prasībām.

Medicīniskās iekārtas un materiāli

Pozīcija/nosaukums

Vienību daudzums

Laminārās plūsmas skapis ar sildvirsmu, gb

1

Stereomikroskops, gb

1

Inkubators CO2, gb

1

Gāzes sistēma inkubatoram ar CO2 balonu, gb

1

Laboratorijas krēsls, gb

1

Seroloģisko pipešu sūknis, gb

1

Mikropipete 10 – 100 µl, gb

1

Seroloģiskās pipetes (10 ml) , gb

2

Flex pipete, gb

1

Mikropipetes uzgaļi, gb

2

Flex pipetes uzgaļi, gb

2

4-lauciņu plate, gb

1

Petri plate, gb

1

Komerciāli pieejams, sertificēts IVM šķīdumu komplekts, gb

1

LAG vide (komplekta sastāvā), ml

3

IVM vide (komplekta sastāvā), ml

9

Cilvēka horiona gonadotropīna šķīdums (cHG) (100 mlU/ml), µl

10

Cilvēka folikulu stimulējošais hormona šķīdums (cFSH) (75 mlU/ml), µl

100

Pacientes serums, ml

1

Cepurīte, gb

1

Sejas maska, gb

1

Lateksa cimdi (pāris), gb

2

Marķieris, gb

1

Aprēķinos nav iekļautas izmaksas par: telpu īri, elektroenerģiju, ventilācijas sistēmu un tās apkopi, IT sistēmas nodrošinājumu un programmatūrām, personāla atalgojumu, instrumentu dezinfekciju un sterilizāciju, telpu uzkopšanu, administartīvajiem izdevumiem (uzņemšana, grāmatvedība, kanceleja).

Latvijas Cilvēka Reprodukcijas Biedrība

2019. gada 28. jūnijā